台灣紅豆杉 抗癌藥物 紫杉醇 的另一個家

台灣紅豆杉  抗癌藥物  紫杉醇  的另一個家

文章來自：行政院農業委員會網站

作者：何政坤 行政院農業委員會林業試驗所育林組

張貼日期：2003/4/15

圖說：臺灣紅豆杉的枝葉與果實。

一種萃取自太平洋紫杉的「紫杉醇」與寄生在太平洋紫杉上的一種真菌所生產的「紫杉醇」，是被寄予厚望的癌症治療藥物；然而這種藥物來源稀少。所幸，從原生樹種──臺灣紅豆杉也能製造出紫杉醇。

臺灣紅豆杉（學名：Taxus sumatrana (Miq.) de Laub.，紅豆杉科）或稱南洋紅豆杉，屬於裸子植物，是臺灣貴重針葉五木之一。臺灣針葉五木包括檜木類、臺灣杉、香杉、臺灣肖楠與本文所述的臺灣紅豆杉，它們都是臺灣最珍貴的樹種，木材品質優異，被分類為針一級木，多屬於高大的喬木。紅豆杉稀疏地分布在臺灣全島海拔二千公尺上下的山區，在相當於人的胸部高度處，量取的直徑都在一公尺以上，樹高達二十公尺以上，樹幹略扭曲，比起其他四種針葉木，它是樹形較矮胖、樹姿較醜的樹種。 可是別看它醜，它包被紅色假種皮的果實，狀如紅豆，是所有針葉五木中果實最鮮豔漂亮的。它的木材也比其他四種顏色豐富，樹心的部分是紅色，邊緣的部分是黃色，是很好的雕刻用材。木材雕刻家曾將臺灣紅豆杉木材雕刻成一人高的觀音，售價高達一千萬元。 民國七十年代，臺灣紅豆杉因懷璧其罪，不斷地慘遭盜伐；政府查禁後，初期對沒入的盜伐木，採取公開標售的方式處理，在民國七十八年時，一棵盜伐木標售到一百八十萬元，創下臺灣盜伐木標售的最高紀錄。為了杜絕這些破壞臺灣天然林木的山老鼠，先盜伐再藉政府標售方式合法取得，在民國七十九年時立法院特地立法禁止臺灣紅豆杉盜伐木標售，終於澈底斷絕臺灣紅豆杉遭盜伐利用的厄運。 抗癌藥物紫杉醇  約在民國五十五年時，美國的「國家癌症研究中心」從太平洋紫杉（學名： Taxus brevifolia Nutt.）的樹皮中萃取出紫杉醇（Paclitaxel 商品名 Taxol），發現它具有抗癌的效果，經過一連串的臨床試驗，民國七十八年正式製成製劑用來治療卵巢癌與乳癌。由於它的治療效果甚佳，使得太平洋紫杉被預言為「二十世紀對人類貢獻最大的植物」。 不過太平洋紫杉生長緩慢，從樹皮萃取紫杉醇的產量又甚低，以治療一個卵巢癌病患需要二公克紫杉醇而言，就需要砍伐二到三棵 50 ~ 60 年生的太平洋紫杉，如要萃取一公斤的紫杉醇，就需要砍伐二千至四千株的太平洋紫杉。所以當時一公克的紫杉醇售價高達八百美元，於是全世界研發人員開始投入如何量產紫杉醇的研究工作。 對林木育種家而言，最直接的方式就是選育高紫杉醇含量的品種，而且最好是枝葉含有高濃度紫杉醇的品種，畢竟枝葉是可以不斷再生、不斷採收的。如果紫杉醇的取得是來自於樹皮，因為樹木一經剝皮就會死亡，其生產成本勢必過高，而且收成時間也過久。 對化學家而言，則是利用合成的方式，由簡單且容易取得的化學單元體合成紫杉醇，民國八十三年實驗成功了，總共經過 28 個步驟，化學家可在試管內完全合成紫杉醇，當時可是一件大事！雖然最後合成的紫杉醇產率僅有 0.5％，不過化學家並不氣餒，他們知道如果將合成的步驟縮短，就有商業化生產的價值。 經過多方尋覓，最後發現紅豆杉的萃取物中含有濃度甚高的紫杉醇主結構 10－去乙醯巴卡亭III（簡稱 10-DAB），這種成分在少數紅豆杉品種的枝葉中濃度高達 1,000 ppm（ppm，每公斤乾重的毫克數），是紫杉醇的三倍以上。利用 10-DAB 作為合成的起始物，只要約 10 個步驟就可合成紫杉醇，在實驗室中的合成率可達 80％ 以上，這種方法稱為半化學合成法，以別於全合成法。 對生物學家而言，是積極尋找可以生產紫杉醇的微生物，他們發現寄生在太平洋紫杉上的一種真菌可以生產紫杉醇，由於真菌生長快，用來生產紫杉醇相當看好。對組織培養學家而言，就是想辦法在發酵槽內培養紅豆杉細胞，利用細胞來生產紫杉醇；組織培養學家本來就很有興趣利用細胞培養生產人類需要的藥物，但是成果並不理想，主要的原因是這些藥品的價格還沒有高到使廠商有投入量產的意願。如今終於有一種這麼昂貴的藥物，而且需求量又不斷增加。 根據最近的統計，紫杉醇在全球的市場需求量高達十八億美元，占所有抗癌藥物市場的 25％！因此帶動了全世界細胞培養的研究熱潮，目前最大的發現就是找出了一種叫做甲基茉莉酸（methyl jasmonate）的誘導物質，它可使紅豆杉細胞生產紫杉醇的產量暴增 10 倍以上。 另外，目前最熱門的生物技術學家又如何看待紫杉醇的生產呢？他們則是從找尋合成紫杉醇的基因著手，近三年內他們差不多已經將這些基因選殖出來了，接著便是如何將基因轉殖到紅豆杉細胞中，甚至是微生物，讓它們為我們生產廉價的紫杉醇。 紫杉醇的原料來源  前面談了許多紫杉醇的生產方法，經過 10 年的開發，紫杉醇原料價格從剛開始的每公克八百美元，滑落到目前的三百美元，價格雖降低頗大，但是仍相當昂貴。大家一定很好奇，究竟哪種生產方法是原料的主要來源？答案有點出乎意料，目前是以半化學合成法為主，而原料就是 10-DAB，提供 10-DAB 來源的植物，主要是歐洲紅豆杉的枝葉！ 採取半化學合成法的主要原因，除了 10-DAB 在枝葉中的含量是紫杉醇的三倍以上外，另一個重要因素是天然的紫杉醇再怎麼純化，總會含有微量的雜質，這些微量雜質會隨栽培方法、環境變化而異，造成品管上的困難。同樣是純度 99％ 的天然紫杉醇，永遠難以保證不同批原料的雜質是一致的，這些雜質均須通過檢驗，證明它們對人體無害，才能進一步製成藥劑。 反之，半合成紫杉醇經過合成步驟，它的純度高且每批產品品質幾乎一致，合乎藥檢的標準，儘管比天然紫杉醇生產麻煩，但是生產成本不一定比天然紫杉醇高。目前 10-DAB 原料是每公克 90 美元以下，假如每二公克可合成一公克紫杉醇，那就是投入 180 美元可以生產三百美元的藥物，仍有 120 美元的價差，扣除生產成本後仍有極大的利潤。不過這種半化學合成法的技術已經成為專利了，用此一技術生產紫杉醇，要付出高額的專利費。目前，國內的製藥界另行開發了獨特的半合成技術，也可以利用 10-DAB 生產紫杉醇了。 當全世界紛紛投入紅豆杉屬相關樹種的開發研究時，臺灣紅豆杉究竟是否有潛力發展出跟國外具有競爭力的品種或生產模式？然而，當我們開始注意到本土的紅豆杉是否有開發價值時，已經是民國八十三年的事了，比國外的研究足足晚了將近五年。因此當國內學者提出臺灣紅豆杉的優良化學品系選育計畫時，就有人質疑是否可以跟國外具有十分完備的研究機構競爭？如果真有優良的化學品種，以臺灣如此高的土地與人力成本，還會有生產空間嗎？ 當學者們想進一步研發，利用臺灣紅豆杉細胞培養生產紫杉醇時，就有人質疑紅豆杉細胞的培養技術國外已經取得專利了，臺灣有能力跟國外競爭嗎？研發出來的技術可能也在國外專利的範圍內，還會有經濟價值嗎？常常我們也會自我反問這些問題，最後總覺得為了了解臺灣本土的資源，建立並保存可能產品化的機制，應該責無旁貸地進行相關研究。 前面提過臺灣紅豆杉的木材價值已經很高了，大家或許認為栽植臺灣紅豆杉經濟價值鐵定極大，可是針對 15 公分直徑小樹的年輪加以計算，竟然高達兩百多歲，對於胸徑一公尺的大樹需要多少年才能長成，就可想而知了。 為了避免這些大樹的基因流失，林業試驗所在民國八十三年，開始進行臺灣紅豆杉的調查與枝葉含紫杉醇濃度的分析；在進行調查分析的同時，也加以採種，利用種子發芽育苗，此外也採集枝條，利用扦插發根成苗，以保存該母樹的基因；更進一步從優良母樹的枝葉進行組織培養，誘導未分化的細胞團（稱為癒合組織）產生，探討以細胞培養生產紫杉醇的可行性；最後透過生物技術，將外來基因成功轉殖到臺灣紅豆杉細胞內。 不可否認的，國內對臺灣紅豆杉的研發工作仍是跟著國外的腳步，但是，這並不意味著我們的產品就會輸給國外。以下就讓我們來看看臺灣利用紅豆杉生產紫杉醇的研究與產業發展潛力。 利用臺灣紅豆杉生產紫杉醇  要在國內以大面積栽培臺灣紅豆杉，再利用機械化採割枝葉以萃取 10-DAB 原料，其栽培方式就像經營茶園一樣，被選育出來的臺灣紅豆杉化學品系必須具備下述條件：臺灣現有產業界具備將 10-DAB 合成紫杉醇的專利技術；10-DAB 在樹梢枝葉中的含量必須高過國外品種；枝葉產量高且耐修剪；由於臺灣低海拔面積較多，所以該品系必須具備耐熱性，可以在低海拔栽培。 為了選育具有這些條件的品系，於是從全臺灣採集天然母樹的枝葉，分析 10-DAB 的含量，將含量較高的品系篩選出來，利用扦插繁殖法，培育出跟天然母樹基因完全一樣的營養系分株，稱之為營養系苗，然後將這些營養系苗栽培到臺灣低中海拔，進行生長與 10-DAB 含量的檢測試驗。結果發現有一些優良的化學品系，可以符合上述的條件，在海拔約七百公尺左右，栽植四年後，它們的枝葉產量每株平均約可生產三公斤，曬乾後約有一公斤重，可萃取出一公克左右的 10-DAB，如果一公頃種植一萬株，就可生產出約 10 公斤的 10-DAB。 此一產值吸引了具有合成紫杉醇技術的臺灣製藥公司加入量產的研發計畫，目前正積極利用扦插繁殖的技術，採集這些優良化學營養系的枝條，利用具有定時噴水系統的溫室，直接扦插在含有泥炭土與蛭石的介質中，約三個月就有 80％ 插穗發根成苗，再經三個月培養後，就可移到栽培地栽植。此項計畫預計在五年內建立面積一百公頃的生產區，屆時臺灣就可以使用到由臺灣紅豆杉生產的紫杉醇了。 一般植物細胞培養的方法，都是先採集植物的組織或器官，如葉片、莖段等，經過酒精與漂白水消毒後，培養在含有營養成分與植物生長激素的固體培養基中。在植物生長激素的誘導下，讓植物的組織細胞分裂成鬆軟的細胞團，然後將這個細胞團移入含有培養液的三角瓶內，培養液的體積一般是三角瓶體積的五分之一，約為 50 毫升，這樣可以增加液體搖盪的速度及溶氧的能力，然後將三角瓶放在迴轉式震盪器中培養，迴轉的次數一般都在每分鐘一百次左右。 鬆軟細胞團在培養液中不斷地迴旋震盪，1 ~ 50 個細胞左右的小細胞團就會脫離原細胞團，最後逐漸成為均勻的細胞散布在培養液中，此一過程稱為懸浮細胞培養。由於細胞整個浸泡在培養液中，吸收養分的面積比固體培養僅靠接觸表面的吸收來得大，所以細胞的增殖速率也遠比固體培養的大。 當細胞在培養液中已經快速生長且紫杉醇濃度產量也很高時，這時候就將它們移到 2 ~ 5 公升的小型生物反應器中培養。生物反應器的基本構造是一圓柱型玻璃或不銹鋼筒，內含攪拌葉片使細胞能懸浮在培養液中，同時設有通氣管，將空氣打入培養液內，提供細胞呼吸所需的氧氣。因為在相同的單位面積上，一個生物反應器可以培養比三角瓶大上數倍的容積，所以在商業性生產時就必須採用生物反應器。如果細胞在小型的生物反應器中仍然有很高的紫杉醇產量，在商業性量產規模的規畫下，此時生物反應器的容積可高達數十噸。 根據多年的研究，發現利用細胞培養生產紫杉醇，最關鍵的因子就是優良的細胞株！就像前面所述的化學優良品系選育一樣，來自不同母樹的細胞株，在培養液中的表現也會呈現極大的差異。優良的細胞株需要具備生長快、紫杉醇濃度高，而且經過長期培養不會降低生產力等特性。經過將近八年的努力，長期監控數十個細胞株的表現，終於選育出符合上述特性，可以用來生產紫杉醇的優良細胞株，目前如利用三角瓶培養，該細胞株可以每天每公升生產五毫克以上的紫杉醇。 根據報導，國外用來培養紅豆杉細胞的生物反應器的容積已高達 75 公噸，如果將該細胞株放入 75 公噸的生物反應器中生產，每天將可生產 75 公克的紫杉醇，也就是一年可生產約 27 公斤的紫杉醇！不過目前尚未看到產品。林試所的研究團隊證實將本土選的優良細胞株培養在二公升的生物反應器中，發現仍能維持很高的紫杉醇產量，此一結果已引起業界的投資興趣，規劃用更大的生物反應器來生產紫杉醇。 遺傳工程與生物技術被認為是影響二十一世紀人類生活最重要的科技。此一技術是否能用來增加培養細胞的紫杉醇產量呢？答案是肯定的！一個成功的遺傳工程除了要有影響紫杉醇合成的基因外，還要有將基因轉殖到紅豆杉細胞的技術。目前已知控制紫杉醇合成的基因大約有 10 個以上，其中最重要的基因是將 10-DAB 催化為巴卡亭（BC）的去乙醯巴卡亭轉移酶（DBAT）基因。 由於控制紫杉醇的基因數目太多了，在遺傳工程上要將這麼多的基因全部轉殖到紅豆杉細胞上，技術甚為困難，通常會選擇最關鍵的基因轉殖，來達到目標產物生成的目的。10-DAB 與巴卡亭都是極佳的產物，因為它們均可經半合成而成為紫杉醇，而且分子大約是紫杉醇的三分之二，細胞較容易將它們釋放到培養液中，所以從培養液中可以不斷地得到此二項產物。 如果將可令 DBAT 大量合成的順義 DBAT 基因或可抑制 DBAT 合成的反義 DBAT 基因轉殖到紅豆杉細胞內，前者會增加 DBAT 基因的表現，使 10-DAB 快速合成巴卡亭；而後者剛好相反，將 DBAT 基因的表現抑制，所以細胞僅能合成到 10-DAB，如此一來細胞就僅能生產 10-DAB 產物。目前研究人員已經成功選殖出 DBAT 基因，並且嘗試將它轉殖到臺灣紅豆杉的細胞內，預期它能夠對細胞生產 10-DAB 產生影響，又因為它的分子量小於紫杉醇，可以不斷地分泌到培養液中，這樣就可以建立連續收穫 10-DAB 的生產模式。 目前基因轉殖的方法雖然很多，但以農桿菌為媒介的轉殖法最為常用。農桿菌原是一種土壤的病原菌，當植物受傷時，細胞會分泌一種酚類物質，誘使農桿菌內的小環形染色體（稱之為質體）中的一段去氧核醣核酸（DNA）切離菌體，移轉到植物細胞內，並嵌入細胞內的染色體中，讓植物細胞產生該段 DNA 上的各種功能。 該段 DNA 具有生產促進細胞產生腫瘤或不定根的植物生長激素基因，以及供農桿菌生長的特殊營養成分。當植物細胞帶有該段 DNA 後，就會形成腫瘤，或者形成毛狀根群。如果利用野生的菌種去感染臺灣紅豆杉，就會產生可自行生長的細胞腫瘤或毛狀根群，與正常細胞需要植物生長激素才能生存完全不同。由於此一段 DNA 插入到植物細胞染色體上的位置不同，插入的數目也不一樣，因此轉殖基因細胞與毛狀根群在生產紫杉醇的表現，也會產生很大的差異。 目前它們的生產量尚低於正常的細胞培養，不過生長速率卻相當快，培養容易且帶有獨特的基因標誌，不會侵犯到目前許多的細胞培養專利技術是其重要的特性。林試所從許多野生的菌種中篩選能夠很快感染臺灣紅豆杉的菌株，它們的感染率可高達 30％ 以上，選擇此一菌種，利用遺傳工程的技術，將致病的基因切除改植入 DBAT 基因，然後再去感染台灣紅豆杉的細胞，這樣就可獲得轉殖 DBAT 基因的紅豆杉細胞了！ 利用臺灣紅豆杉生產紫杉醇，在可見的未來，將會為臺灣創造數十億元的商機。利用大面積栽培台灣紅豆杉是比較傳統的生產方式，投資額大，但植物產量容易控制，風險低。利用細胞培養或根部培養，是一種可以用自動化工廠經營的生產模式，然而每一個製程都必須小心，防止生物反應器可能遭受到細菌與霉菌的污染，同時還要防止細胞在培養過程中難以避免的變異（突變），也就是說每批產品可能會有相當程度的差異，不過由於目前細胞的產量頗高，細胞輕微的變異仍可以忍受。為了防止細胞變異的發生，需要開發出低溫保存細胞的方法，一旦利用生物反應器培養的細胞劣化，立刻可以用低溫保存的細胞加以替換。 轉殖有植物生長激素基因的細胞，因培養在不含植物生長激素的培養液中，產生細胞變異的機率比較小，又帶有基因標誌，可以避開國外在培養基與細胞株上的專利，是頗有發展潛力的技術，但仍須進行更多的研究，以提高紫杉醇的產量。至於轉殖 DBAT 基因以促進紅豆杉細胞生產 10-DAB 或 BC，則是未來看好的細胞培養方式。 雖然國外科學家從太平洋紫杉與歐洲紅豆杉選殖出來的 DBAT 基因已經獲得專利，而從臺灣紅豆杉選殖出來的 DBAT 基因與該二樹種胺基酸序列的相似度高達 95％ 以上，如果國內使用該基因必須付專利費；但紅豆杉的基因轉殖系統，其技術發展在臺灣已頗為成熟，相信一定可以比國外更早一步得到轉殖 DBAT 基因的細胞，尤其是反義 DBAT 基因（並未被取得專利），以大量生產 10-DAB 供臺灣業界直接使用。 最後，在臺灣紅豆杉的研究過程中，讓我們深深地體會到研發技術固然重要，但擁有豐富的植物資源更為重要！如果我們研究的是外來品種，要選出優良的化學品系本身就很困難，要適應臺灣的環境更是需要漫長的時間檢驗。臺灣紅豆杉的研發腳步雖然慢，但是整個研發體系是建立在最基礎的傳統育種收集，到各種珍貴品系的選拔，才能建立自有的化學品系、細胞培養與遺傳工程技術，加上國內的製藥界也不斷地追求技術的創新，讓國內的研究團隊，能夠有機會利用本土的臺灣紅豆杉，為臺灣創造大規模生產紫杉醇的產業。

相關附件：《科學發展》2003年4月，364期，22～29頁